摘 要： 蛋白质吸附、钙磷离子释放和表面生物矿化是钙磷材料诱导异位骨生成的可能材料机制。对比了非表 面微孔羟基磷灰石陶瓷（ＨＡ－Ｓ）、表面微孔羟基磷灰石陶瓷（ＨＡ－Ｒ）和表面微孔生物惰性非钙磷陶瓷（ＴｉＯ２ 陶瓷； 氧化铝陶瓷；两者无钙磷释放，无表面生物矿化能力）的异位骨诱导能力。研究发现，不同化学成分的陶瓷材料对 蛋白质有选择性吸附。即使不吸附骨形态发生蛋白－２（ｒｈＢＭＰ－２），具有表面微孔的非钙磷陶瓷也能诱导异位骨 组织生成。结果表明，钙磷离子释放和表面生物矿化在磷酸钙生物材料骨诱导中不起关键作用，表面微孔也不一 定通过蛋白质吸附而在异位骨诱导中起作用。
０ 引 言
发生在非骨部位的骨再生生物学过程叫骨诱导， 骨诱导较的例子是含有骨形态发生蛋白（ＢＭＰ） 的种植体在软组织中的骨组织生成。在不加生长 因子的情况下，具有特殊物理化学特性的磷酸钙陶瓷 也具有骨诱导能力。其中，材料表面微孔性扮演重 要角色。具有表面微孔的羟基磷灰石陶瓷在肌肉种植 后能够诱导骨组织生成，但是没有表面微孔的羟基磷 灰石陶瓷没有骨诱导能力。
由于磷酸钙材料对骨形态发生蛋白（ＢＭＰ）有较 强的吸附能力，具有表面微孔的磷酸钙陶瓷的骨诱导 作用通常被解释为微孔扩大了磷酸钙陶瓷的表面积， 从而可以从体液中吸附更多的蛋白质（包括骨诱导因 子如ＢＭＰ），而这些被吸附在钙磷陶瓷表面的蛋白质 骨诱导因子较终诱发了骨组织形成。
另外近年来发现钙，磷离子对多潜能干细胞的骨 相分化有促进作用。磷酸钙陶瓷表面微孔在骨诱 导中的作用也被解释为微孔增加磷酸钙陶瓷的表面 积，从而有利于钙磷离子的释放，释放的钙磷离子可能 引发骨诱导。
磷酸钙材料是典型的生物活性材料。在体液中磷 酸钙陶瓷材料能在其表面形成类骨磷灰石层。磷 灰石层的形成以及在磷灰石层形成过程中参与进来的蛋白质（包括生长因子）也被认为是磷酸钙陶瓷骨诱导 的可能原因。
本文考察了不具备表面微孔的羟基磷灰石陶瓷 （ＨＡ－Ｓ），具备表面微孔的羟基磷灰石陶瓷（ＨＡ－Ｒ）， 具备表面微孔的ＴｉＯ２ 陶瓷和氧化铝 陶瓷的蛋白吸附 能力，并比较这些陶瓷材料的异位成骨能力。以期论 证蛋白质吸附，钙磷离子释放和表面生物矿化在生物 材料异位骨诱导中的可能作用。
１ 实 验
１．１ 材料制备
陶瓷材料用双氧水发泡，并在高温下烧结制备。 具体来说，羟基磷灰石粉末（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ），二氧化 钛粉末（Ｆｌｕｋａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）以及三氧化二铝粉末 （Ｆｌｕｋａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ），分别用稀释的双氧水溶液（２％ （质量分数））混合均匀，然后在６０℃进行发泡和干燥， 制备成陶瓷坯体。ＨＡ胚体在１ ２５０℃烧结８ｈ得到 非微孔的的羟基磷灰石陶瓷（ＨＡ－Ｓ），在１１００℃烧结 ８ｈ得到微孔的羟基磷灰石陶瓷（ＨＡ－Ｒ）。ＴｉＯ２ 陶瓷 在１２００℃烧结２００ｍｉｎ，氧化铝 陶瓷在１３００℃烧结 １０ｈ。烧结后的陶瓷块加工成直径为５ｍｍ，长度为 ６ｍｍ的柱状样品，然后分别用丙酮，７０％（质量分数） 乙醇和去离子水很声清洗，干燥后在１２１ ℃下灭菌 ３０ｍｉｎ。
１．２ 材料表征
用Ｘ射线衍射仪（Ｘ’Ｐｅｒｔｐｒｏ－ＭＰＤ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ） 分析陶瓷材料的化学成分；对材料的表面结构 进行扫描电镜（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｓ４８００，Ｊａｐａｎ）观察；用ＢＥＴ （ＴｒｉｓｔａｒⅡ３０２０，Ａｍｅｒｉｃａ）方法检测陶瓷材料的表面 积。
１．３ 牛血清蛋白（ＢＳＡ）和溶菌酶素（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）的吸 附
将陶瓷样品（ｎ＝３）分别浸泡在３ｍＬ含有２５× １０－６叠氮化钠（ＮａＮ３）和２００μｇ／ｍＬ牛血清蛋白（Ｆｌｕｋａ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）或者２０μｇ／ｍＬ 溶菌酶素（Ｆｌｕｋａ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）或者１％（质量分数）胎牛血清（ＦＢＳ， ＧｉｂｃｏＴＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＫ）溶液中，并在 ３７℃水浴中震荡。７ｄ后，将样品离心（３ ０００ｒ／ｍｉｎ） ５ｍｉｎ，取上清液作蛋白分析。用ＢＣＡ 蛋白浓度检测 法（Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡＴＭｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ，ｐｉｅｒｃｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）检测蛋白质，并用相应蛋白 的标准曲线计算蛋白浓度。
１．４ ｒｈＢＭＰ－２的吸附 将４种陶瓷样品（ｎ＝３）浸泡在３ｍＬ含有５００ｎｇ ｒｈＢＭＰ－２／ｍＬ（Ｈｕａｄｏｎｇ Ｅａｓｔ－Ｃｈｉｎａ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｇｒｏｕｐ ｉｎｖｅｓｔｍｅｎｔ Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）的细胞 培养液中。细胞培养液由ＤＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＴＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＫ），１０％ 胎牛血清（ＦＢＳ）（ＧｉｂｃｏＴＭ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＵＫ），１００μｇ／ｍＬ盘尼西林和１００μｇ／ｍＬ链霉素组成。样品在３７ ℃，５％ ＣＯ２ 培养箱中孵化２４ｈ后，用磷酸盐缓冲液（ｐＨ 值＝ ７．４）润洗３次，并保存在－８０℃。１２ｈ后每个样品添 加０．５ｍＬ １％ Ｔｒｉｔｏｎ并在４℃冰箱保存。１２ｈ后，样 品在很声波水浴中处理５ｍｉｎ。离心（Ｘ３ ０００ｒ／ｍｉｎ） ５ｍｉｎ，依照ｒｈＢＭＰ－２酶联免疫反应测定法（ｒｈＢＭＰ－２ Ｅｌｉｓａ，Ｒ＆Ｄ，ＵＫ）测定上清液中的ｒｈＢＭＰ－２蛋白浓 度。
１．５ 动物实验
６条成熟雄性狗（体重为１０～１５ｋｇ）在本地购买。 麻醉（戊巴比妥钠（３０ｍｇ／ｋｇ）），消毒（酒精，碘伏）后， 在狗背部用手术刀划开一个纵向皮肤切口并暴露肌 肉，再钝性分开肌肉成袋状，将样品植入肌肉袋中。
４个单独的肌肉袋间隔２ｃｍ 左右，每个肌肉袋中种植 一个样品。手术后，肌肉连续注射青霉素３ｄ，防止感 染。１２周后，用过量的戊巴比妥钠处死动物，取出样 品并固定在４％的福尔马林溶液中（ｐＨ 值＝７．４）。 １周后，取出样品，用ＰＢＳ冲洗，梯度酒精（７０％，８５％， ９０％，９５％，１００％×２）脱水，ＭＭＡ包埋。硬组织切片 机（Ｌｅｉｃａ ＳＰ－１６００，Ｇｅｒｍａｎｙ）切片（１０～２０μｍ）。亚 甲基蓝和品红染色后，作定性和定量的组织学观察。
为了组织形态学分析，切片首先用扫描仪（Ｄｉｍａｇｅ Ｓｃａｎ Ｅｌｉｔｅ ５４００ＩＩ，Ｊａｐａｎ）扫描，然后用ＰｈｏｔｏｓｈｏｐＣＳ５ 处理图片，读出选中区域、材料、骨头三者的像素值，根 据公式
计算陶瓷材料大孔中的成骨量和材料在样品中的 百分比。用光学显微镜（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ２００，Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）观察样品中的组织成分（血管，新生骨组织和成 骨细胞）。
１．６ 统计学分析
数据均采用平均值加减标准方差的形式表达。用 量化Ｔｕｒｋｅｙ对比对数据进行单因素方差统计分析，ｐ ＜０．０５被认定为显著性差异。
２ 结果与讨论
２．１ 材料表征
材料的ＸＲＤ图谱如图１所示。由图１可知，ＨＡＳ 和ＨＡ－Ｒ在不同温度烧结（ＨＡ－Ｓ，１２５０℃；ＨＡ－Ｒ， １１００℃），但它们的特征峰与标准羟基磷灰石一致。 ＴｉＯ２ 在２θ＝２７．６，３６．２８，４１．４，５４．５，５６．７８和６９．１６°有 明显的特征衍射峰，与ｒ－ＴｉＯ２ 的ＸＲＤ 标准峰一致。
氧化铝 在２θ＝２５．７，３５．３，３７．９，４３．４８，５２．６８，５７．６２， ６６．６２和６８．３２°处有明显的特征衍射峰，与α－氧化铝 的 ＸＲＤ标准峰一致。
从图１可知，１ ２５０℃烧结后，ＨＡ晶体熔融在一起，导致ＨＡ－Ｓ形成较光滑的表面（图２（ａ）），但是 １ １００℃烧结的ＨＡ－Ｒ表面有丰富的微孔（图２（ｂ））。 ＴｉＯ２ 表面同样可以看到丰富的微孔（图２（ｃ））。在 １ ３００℃下，很少氧化铝 晶体（细微颗粒）熔融，颗粒堆 叠在一起形成微孔（图２（ｄ））。ＢＥＴ 无法检测ＨＡ－Ｓ 表面积，ＨＡ－Ｒ的表面面积为０．７７７ｍ２／ｍＬ，ＴｉＯ２ 的 表面面积为０．１０２ｍ２／ｍＬ，氧化铝 为０．２０６ｍ２／ｍＬ（表 １）。４种不同的微孔表面结构，材料的表面积不同。
２．２ 蛋白吸附
浸泡７ｄ后，不同材料吸附牛血清蛋白（ＢＳＡ）的 能力各不相同（图３（ａ））。ＨＡ－Ｓ吸附（６４±８）μｇ ＢＳＡ （占总ＢＳＡ的（１１±１）％），ＨＡ－Ｒ吸附（４８５±５）μｇ ＢＳＡ（占总ＢＳＡ的（８１±１）％），ＴｉＯ２ 吸附（１８２±１２）μｇ ＢＳＡ （占总ＢＳＡ 的（３０±２）％），氧化铝 吸附（２１７±１６）μｇ ＢＳＡ（占总ＢＳＡ的（３６±３）％）。
浸泡7ｄ后，不同材料吸附溶菌酶素（ｌｙｓｏｚｙｍｅ） 的能力各不相同（图３（ｂ））。氧化铝 能吸附溶菌酶素 较多，ＨＡ±Ｓ吸附较少。ＨＡ±Ｓ吸附（１±１）μｇ（占总 量（２±２）％），ＨＡ±Ｒ 吸附（６±１）μｇ（占总量（１０± ２）％）。ＴｉＯ２ 吸附（２０±１）μｇ（占总量（３３±１）％）。
氧化铝 吸附（５１±１）μｇ（占总量（８５±１）％）。 浸泡７ｄ后，不同材料吸附ＦＢＳ的能力也不一样 （图３（ｃ））。ＨＡ－Ｓ吸附较少（占总量的６％），ＨＡ－Ｒ吸 附较多（占总量的３４％），ＴｉＯ２ 和氧化铝 吸附的量大 致一致（分别占总量的１２％和１２％）。
陶瓷材料化学成分不一样，蛋白质吸附能力不同。 微孔的ＨＡ－Ｒ总比无微孔的ＨＡ－Ｓ吸附更多的蛋白 质，说明对于同一材料，蛋白质吸附与材料微孔和表面 积有关。
２．３ ｒｈＢＭＰ－２吸附
ＨＡ对ｒｈＢＭＰ－２有很强的吸附能力，与微孔和表 面积有关，而ＴｉＯ２ 和氧化铝 陶瓷对ｒｈＢＭＰ－２的吸附 能力很弱（图４所示）。
浸泡２４ｈ后，ＨＡ－Ｓ吸收（２１．４±４．６）ｎｇ ｒｈＢＭＰ－２ （占总量的（１．４０±０．３３）％），ＨＡ－Ｒ 吸收（４２．９±５．３）ｎｇ ｒｈＢＭＰ－２（占总量的（２．８７±０．３３）％），ＴｉＯ２ 吸收 （２．２±０．８）ｎｇ ｒｈＢＭＰ－２（占总量的（０．１３±０．０６）％）， 氧化铝 吸附（０．４±０．２）ｎｇ ｒｈＢＭＰ－２（占总量的（０．０２± ０．０１）％）。这个结果验证了钙磷陶瓷对ＢＭＰ有较强 的亲和力，但结果也同时显示ＴｉＯ２ 和氧化铝 陶瓷对 ｒｈＢＭＰ－２的吸附能力很弱。
２．４ 陶瓷材料的成骨能力
肌肉种植１２周后，所有ＨＡ－Ｒ，ＴｉＯ２，氧化铝 植入 体都有骨组织生成，但在ＨＡ－Ｓ中没有骨生成（表１）。 在ＨＡ－Ｓ里只发现纤维组织和血管（图５（ａ），（ｅ））。除 了纤维组织和血管外，在ＨＡ－Ｒ的大孔表面还发现有 矿化的骨组织（图５（ｂ），（ｆ））。与ＨＡ－Ｒ 类似，ＴｉＯ２ （图５（ｃ），（ｇ））和氧化铝（图５（ｄ），（ｈ））大孔中有纤维 组织，血管和新生骨组织。
组织形态定量分析总结在图６和表１，陶瓷种植 体具有不同材料百分比。ＨＡ－Ｓ中材料占（５０．７± ２．８）％，ＨＡ－Ｒ中材料占（５２．４±５．１）％，ＴｉＯ２ 中材料 占（６３．５±１３．３）％，氧化铝 中材料占（６３．５±１０．２）％。 样品中的成骨量也有差异。ＨＡ－Ｒ中成骨量为（７．６± ３．０）％，ＴｉＯ２ 中成骨量为（１．９±１．０）％，氧化铝 中成骨量 为（１２．１±５．６）％。由于制备陶瓷的材料百分比不同 （表１），陶瓷有不同的孔隙率，因而无法排除大孔孔隙 率对成骨量的可能影响。但单从新骨发生率的不同， 可以讨论材料因素在生物材料骨诱导中的可能功能。
ＨＡ－Ｒ能够吸附更多的ｒｈＢＭＰ－２，ＴｉＯ２ 和氧化铝 陶瓷几乎不吸附ｒｈＢＭＰ－２（图４），而它们都能诱导骨生成（表１，图５和６）。不同化学组分的陶瓷材料蛋白 质吸附（图３和４）和成骨能力的比较不能明确蛋白质吸附在生物材料骨诱导中的关键作用。 由于钙磷离子分别对多潜能干细胞的骨相分化有 促进作用，钙磷离子释放也通常作为解释磷酸钙陶瓷 诱导成骨的原因之一［４］。本文中，骨组织再生除了发 生在微孔结构的ＨＡ－Ｒ 里，也发生微孔ＴｉＯ２ 和 氧化铝 陶瓷里。因为ＴｉＯ２ 和氧化铝 陶瓷根本无法释 放出钙磷离子，所以这个结果否定了钙磷离子在骨诱 导中的关键作用。
由于钙磷离子释放和重新表面沉积，材料表面形 成类骨磷灰石层，从而使磷酸钙陶瓷具有生物活性。在类骨磷灰石层形成过程中，体液中的生长因 子参与生物矿化，从而引起生物反应，这也被用来解释 磷酸钙陶瓷骨诱导现象。单纯的ＴｉＯ２ 和氧化铝陶瓷是典型的生物惰性材料，不会在模拟体液中形成表面类骨磷灰石层。所以，ＴｉＯ２和氧化铝陶瓷诱导成骨 的结果否定了生物矿化在生物材料诱导成骨中的关键 作用。 近年来，生物材料的表面物理特性的生物效应研 究取得进展。多潜能干细胞可能根据材料表面微 孔结构而改变它们的形态，而这种细胞形态改变引起 细胞的骨相分化。特异的生物材料表面微孔可能直接诱导骨组织生成。
３ 结 论
（１） ＳＥＭ 和ＢＥＴ的测试结果发现，以双氧水为 发泡剂，高温烧结而成的４种陶瓷具有不同的表面结 构和表面积。
（２） 不同化学组分的陶瓷材料蛋白质吸附和成 骨能力的比较不能明确蛋白质吸附在生物材料骨诱导 中的关键作用。
（３） ＴｉＯ２ 和氧化铝陶瓷诱导成骨的结果表明微 孔并不是通过钙磷离子释放和表面生物矿化而起作 用，也不一定通过蛋白质吸附引起骨诱导。